商品屬性：

本試劑盒采用裂解液，可快速可靠的從病毒液樣本中純化出高純度的總 RNA。該試劑盒是目前國(guó)際上操作步驟最少、用時(shí)最短的病毒 RNA 提取試劑盒（僅需要 5 分鐘）。應(yīng)用本試劑盒提取的 RNA 可直接用于反轉(zhuǎn)錄、基因克隆、定量 PCR 檢測(cè)等多種分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。
注意事項(xiàng)：
(1) 本試劑盒中的 Washing Buffer 中已經(jīng)加乙醇，無(wú)需單獨(dú)添加。
(2) RNA LB1 和 RNA BB2 均具有腐蝕性，注意防護(hù)。
操作方法
（1）裂解/上柱（1.5ml EP 管中處理）
液體樣本：血清、血漿、唾液、痰液、尿液、細(xì)胞培養(yǎng)病毒上清液等液體樣本直接吸取 150 μl 到 1.5ml EP 管中，并加入 120 μl RNALB1，漩渦混合均勻 10 秒。打開(kāi) 1.5ml EP 管蓋，并加入 500 μl RNABB2 中，漩渦混合均勻 10 秒。倒入吸附柱中，13000 rpm 離心 30秒，倒掉過(guò)柱后的廢液，進(jìn)行后續(xù)洗滌/洗脫步驟。
抗凝全血：直接吸取 150 μl 到 1.5 ml EP 管中，并加入 120 μl RNA
LB1，漩渦混合均勻 10 秒。打開(kāi) 1.5 ml EP 管蓋，并加入 500 μl RNA
BB2 中，漩渦混合均勻 10 秒。13000 rpm 離心 30 秒后，將上清液倒入吸附柱中，13000 rpm 離心 30 秒，倒掉過(guò)柱后的廢液，進(jìn)行后續(xù)洗滌/洗脫步驟。
固體樣本：組織、糞便等樣本。取 10~100 mg 固體材料樣本，加入到 300 μl RNA LB1 中（1.5ml EP 管），并加入幾粒鋼珠（一般3~4 粒），置于組織研磨儀中，研磨 1 分鐘。研磨完畢后，打開(kāi)管
蓋，向勻漿液中加入 750 μl RNA BB2，并 13000 rpm 離心 1 分鐘。
打開(kāi)管蓋，用 1 ml 吸頭吸取 750 μl 上清液到吸附柱中。13000 rpm離心 30 秒，倒掉過(guò)柱廢液，進(jìn)行后續(xù)洗滌/洗脫步驟。
（2） 洗滌和洗脫
上述裂解/上柱操作完畢后，向吸附柱中加入 500 μl WashingBuffer，13000 rpm 離心 15 秒，并倒掉過(guò)柱廢液。重復(fù)此洗滌步驟一次。 將吸附柱重新放回離心機(jī)，13000 rpm 空離心 1min，將殘留的乙醇甩干。 將吸附柱芯放入到 1.5 mL Nuclease Free收集管中，向吸附柱芯中加入 20~50 μl Nuclease Free H2O，室溫放置1 min，13,000rpm離心 1min，洗脫液即為提取的病毒RNA，冷凍保存。
特別說(shuō)明：
（1）RNA LB1 和 RNA BB2 含有高鹽，在樣本加入到此溶液后，病毒會(huì)迅速滅活。同時(shí)此溶液對(duì)皮膚有腐蝕性，務(wù)必做好防護(hù)，如接觸到皮膚，用大量清水沖洗。
（2）樣本處理過(guò)程中的吸頭等材料可能含病毒分子，實(shí)驗(yàn)完畢后務(wù)必妥善處理，不能隨意丟棄。

PCR基本步驟及注意事項(xiàng)？

一、實(shí)驗(yàn)原理

PCR是體外人工選擇性擴(kuò)增DNA的一種方法，它類似于生物體內(nèi)DNA的復(fù)制。在生物體內(nèi)DNA復(fù)制需要模板、引物、DNA聚合酶、DNA解旋酶、 dNTPs；而體外PCR反應(yīng)同樣需要類似的成分，有模板、引物、PCR Buffer、Taq酶、dNTPs。其中引物是人工設(shè)計(jì)的特定序列，實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位置的擴(kuò)增；PCR Buffer提供一個(gè)反應(yīng)的緩沖環(huán)境；反應(yīng)過(guò)程同生物體內(nèi)一樣，DNA雙鏈打開(kāi)，引物結(jié)合模板，延伸形成新鏈。而這些過(guò)程在生物體內(nèi)靠DNA解旋酶解鏈，而在體外在通過(guò)控制反應(yīng)溫度實(shí)現(xiàn)的。如常用94℃變性模板DNA打開(kāi)雙鏈，在退火溫度處引物結(jié)合到模板上，最后在72℃完成延伸，并反復(fù)重復(fù)此過(guò)程即可實(shí)現(xiàn)對(duì)特定片段DNA的大量擴(kuò)增。到第三循環(huán)開(kāi)始才產(chǎn)生出和靶DNA區(qū)段相同的DNA分子，進(jìn)一步循環(huán)地產(chǎn)生出靶DNA區(qū)段的指數(shù)加倍。

在擴(kuò)增后期,由于產(chǎn)物積累,使原來(lái)呈指數(shù)擴(kuò)增的反應(yīng)變成平坦的曲線,產(chǎn)物不再隨循環(huán)數(shù)而明顯上升,這稱為平臺(tái)效應(yīng)。平臺(tái)期(Plateau)會(huì)使原先由于錯(cuò)配而產(chǎn)生的低濃度非特異性產(chǎn)物繼續(xù)大量擴(kuò)增，達(dá)到較高水平。因此，應(yīng)適當(dāng)調(diào)節(jié)循環(huán)次數(shù)，在平臺(tái)期前結(jié)束反應(yīng)， 減少非特異性產(chǎn)物。到達(dá)平臺(tái)期(Plateau)所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝。

二、主要的成分

1.模板可以是多種形式，主要包括基因組DNA、質(zhì)粒DNA、攜帶病毒的基因組DNA、PCR產(chǎn)物，cDNA等，但不能為RNA。對(duì)于不同類型的模板，其主要不同在于預(yù)變性的時(shí)間以及模板的量。一般對(duì)于大的基因組DNA預(yù)變性時(shí)間10min足夠，質(zhì)粒DNA2min、攜帶病毒的基因組DNA預(yù)變性2min、PCR產(chǎn)物預(yù)變性2min即可。

注意cDNA為單鏈DNA，但仍可做PCR的模板，只不過(guò)在第一輪循環(huán)時(shí)只有一個(gè)引物結(jié)合，合成另一條鏈。從第二輪開(kāi)始，兩個(gè)引物均與特異位點(diǎn)結(jié)合，從而實(shí)現(xiàn)了與常規(guī)PCR的接軌。而同作為單鏈的RNA卻不能進(jìn)行PCR擴(kuò)增，原因就在于實(shí)現(xiàn)PCR反應(yīng)的是DNA聚合酶，只能特意識(shí)別DNA鏈。

2.對(duì)于模版的量來(lái)說(shuō)，一般25ul體系DNA的質(zhì)量為50—100ng。對(duì)于基因組DNA由于其結(jié)構(gòu)比較復(fù)雜，提取的濃度也往往比較大，為防止?jié)舛冗^(guò)大對(duì)PCR造成影響，故需對(duì)提取的DNA進(jìn)行梯度稀釋。否則濃度過(guò)高則可能會(huì)引起非特異性擴(kuò)增。對(duì)于質(zhì)粒及PCR產(chǎn)物由于其結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，且提取濃度一般較低，則無(wú)需稀釋。

PCR實(shí)驗(yàn)中應(yīng)該注意的問(wèn)題有哪些?

沒(méi)有ct值

檢測(cè)結(jié)果遇到?jīng)]有Ct值情況,排查是否有以下問(wèn)題:

1、循環(huán)數(shù)不夠(一般不超過(guò)45循環(huán),不僅背景值提高,定量也不準(zhǔn));

2、PCR程序設(shè)置錯(cuò)誤,檢測(cè)熒光信號(hào)的步驟有誤。一般SG法采用72℃延伸時(shí)采集,TaqMan法則一般在退火結(jié)束時(shí)或延伸時(shí)采集信號(hào),另外熒光采集是否選中;

3、引物或探針降解。可通過(guò)PAGE電泳檢測(cè)引物和探針是否降解;

4、模板量可能降解或上樣量不足(不超過(guò)500ng,根據(jù)試劑盒說(shuō)明書即可), 對(duì)未知濃度的樣本應(yīng)從系列稀釋樣本的最高濃度做起;如果發(fā)生模板降解,應(yīng)考慮樣本準(zhǔn)備中雜質(zhì)的引入及反復(fù)凍融的情況,建議將模板樣本小量分裝儲(chǔ)備,避免反復(fù)凍融;

5、引物探針是否合適(尤其是引物跨越內(nèi)含子,以確保擴(kuò)增基因組DNA;上下游引物Tm值超過(guò)4℃以上也會(huì)影響擴(kuò)增)。

ct值過(guò)晚

在相對(duì)定量中, Ct值一般控制在15—25之間比較好,如果在絕對(duì)定量中, 對(duì)低拷貝數(shù)的樣品,Ct值會(huì)增大, 但是一般不宜超過(guò)40循環(huán), 否則定量不準(zhǔn)確。

因此,判斷Ct值出現(xiàn)過(guò)晚是否屬于非正常情況, 需要根據(jù)具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)和目的進(jìn)行。

1、擴(kuò)增效率低。引物之間或者引物和探針的比例不合適, 需要進(jìn)行優(yōu)化;引物或探針設(shè)計(jì)不合理, 需要重新設(shè)計(jì);

2、PCR程序不合適, 改用三步法進(jìn)行反應(yīng), 或者優(yōu)化退火/延伸溫度, 可以適當(dāng)降低退火溫度; 退火/延伸時(shí)間短(可以在推薦的時(shí)間條件下延長(zhǎng)10s);

3、MgCl2濃度不合適,增加鎂離子濃度等。PCR各種反應(yīng)成分的降解或加樣量的不足;

4、PCR產(chǎn)物太長(zhǎng)。PCR產(chǎn)物設(shè)計(jì)超過(guò)500bp;

5、模板中存在抑制物。用高純度模板進(jìn)行PCR檢測(cè)或?qū)⒛０暹M(jìn)行稀釋。

公司正在出售的產(chǎn)品：